Buněčná imunita

Základní CD znaky T a B lymfocytů

Znaky CD3, CD4, CD8 (T lymfocyty) a CD19 resp. CD20 (B lymfocyty) představují základní panel povrchových diferenciačních antigenů lymfocytů. Slouží ke stanovení jednotlivých základních populací lymfocytů (T, B ly) a subpopulací T buněk (pomahačské T lymfocyty, CD4+ a supresorové/cytotoxické T lymfocyty, CD8+). Klinická indikace vyšetření: diagnostika a monitorování léčby primárních a sekundárních imunodeficitů. U AIDS dochází při progresi onemocnění k úbytku absolutního počtu CD4+ lymfocytů, jedná se o důležitý prognostický ukazatel. Poměr CD4/CD8 lymfocytů je v rozmezí při hodnocení průtokovou cytometrií 0,8-2,8. Klinická interpretace této hodnoty nesmí být mechanická a v současnosti její význam poklesl v souvislosti se zavedením metody dvojího značení při průkazu povrchových struktur lymfocytů.

Buňky spontánní cytotoxicity (NK)

Stanovování populace přirozených zabíječů (NK buňky), důležitého faktoru přirozené imunity a protinádorového dohledu organismu, je příkladem využití metody dvojího značení. Fenotyp NK buňky je CD3-CD16+CD56+. Povrchový znak CD3 je prokazován pomocí MP značené FITC a charakteristické znaky NK buněk CD16 a CD56 (NKH-1) jsou prokazovány pomocí MP značené phycoerythrinem (PE). Deficience NK buněk byla popsána u Chédiak-Higashi sy, XLP syndromu, některých forem SCID, chronického únavového syndromu atd.

Některé diferenciační a aktivační CD znaky lymfocytů (subpopulace T a B lymfocytů)

Významný posun v charakterizaci subpopulací leukocytů nastal právě díky možnosti prokazovat expresi více znaků na povrchu buňky. Kvalitativní posun spočívá v možnosti lépe definovat diferenciační stadium buňky resp. funkční stav (aktivace). V současnosti je rutinně využíváno dvojí značení pro stanovení aktivačních a diferenciačních znaků především lymfocytárních populací.

Aktivované T lymfocyty jsou prokazovány kombinací znaků CD3/CD25, CD3/CD69 nebo CD3/HLADR, aktivované B lymfocyty kombinací znaků CD19/CD23 nebo CD20/CD23. V B lymfocytární řadě lze stanovit subpopulaci B1 lymfocytů (CD5+ B lymfocytů), která je spojována s produkcí přirozených (auto)protilátek.

Je možné definovat subpopulace CD4+ lymfocytů pomocí exprese produktů alel CD45RA a CD45RO. Th lymfocyty s pozitivitou CD45RA zahrnují antigenem neaktivované pomahačské ly (tzv. "naivní" T ly), exprese CD45RO charakterizuje antigenem aktivované CD4 buňky (dříve "paměťové" T ly). Podrobnější specifikaci Th i dalších lymfocytárních subpopulací umožňuje vícenásobné značení - viz dále.

Další subpopulace Th ly jsou charakterizovány expresí CD62L. Populace CD4+62L+ zahrnuje buňky indukující diferenciaci supresorických T Iymfocytů, populace CD4+62L- představuje Th buňky, které hrají roli v B lymfocytární diferenciaci.

Průkaz exprese znaků CD28 a CD38 umožňuje lépe charakterizovat populaci CD8+ lymfocytů (Ts/Tc). V klinických aplikacích dosud platí, že populace CD8+CD28- zahrnuje Ts buňky, fenotyp CD8+CD28+ buňky Tc. Exprese znaku CD38 na CD8+ je výrazem aktivace, jeho sledování má význam především u virových infekcí (EBV, CMV).

Pro podrobnější charakteristiku lymfocytárních populací využíváme trojího v některých případech i čtyřnásobného značení. V těchto případech jsou kromě základních fluorochromů (fluorescein izothiokyanátu - FITC a phycoerythrinu - PE) využívány i peridinin chlorophyll protein - PerCP se stejnou excitační vlnovou délkou jako předchozí. Dostupnost druhého laseru (diodový laser s excitační vlnovou délkou 635 nm) otevírá možnosti pro použití další skupiny fluorochromů nebo jejich tandemů (např. Allophycocyanin - APC, APC v tandemu s CY7). Pro průkaz paměťových pomahačských T lymfocytů (Th) (CD45RO+CD27+CD4+) a pro tzv. paměťový "Th1 like" a "Th 2 like" fenotyp (CD45RO+CD62L-CD4+ resp. CD45RO+CD62L+CD4+) je sledována exprese CD45RO/CD27/CD4 a CD45RO/CD62/CD4. Pro specifikaci naivních, paměťových či efektorových CD8+ lymfocytů využíváme kombinaci CD27/CCR7/CD8/CD28, CD45RA/CD27/CD8/CD28, CD45RA/CCR7/CD8/CD28, při použití vhodného stimulans lze paralelně detekovat i produkci IFNă.

Samostatnou problematikou je diagnostika krevních malignit, kde možnosti průtokové cytometrie spolu s využitím MP přinesly značný pokrok. V současnosti je na pracovišti možno provádět diagnostiku leukemií podle protokolů, které odpovídají doporučeným panelům diagnostických MP (např. protokol ALL-BFM 95) včetně stanovení cytoplazmatické exprese některých znaků (cIgM, cCD22, cCD3, cMPO, cTdT, cCD79a aj.). V diagnostice krevních malignit musí ale imunol. pracoviště vždy úzce spolupracovat s odd. klin. hematologie.

Leukocytární CD znaky

Pan-leukocytární znaky jsou využívány především pro rozlišení zralých, nezralých, potenciálně maligních leukocytů v buněčné populaci (BAL, kostní dřeň, lymfatické uzliny, biopsie).

Adhezní molekuly

V současnosti velmi široká skupina povrchových molekul buněk nejen imunitního systému. Ze skupiny leukocytárních integrinů se prokazují CD11a, CD11b, CD11c a CD18. Porucha exprese je spojena s těžkým primárním imunodeficitem - deficitem adheze leukocytů LAD-1.

Myelomonocytární znaky

V diferenciální diagnostice myeloproliferací sledujeme expresi znaků umožňující stanovit liniovou příslušnost sledované buněčné populace. (CD4, CD14, CD13, CD33, CD15, CD64, CD65).

Erytrocytární a destičkové znaky

Význam především pro stanovení kvality separace lymfoidních buněk (erytrocytární antigen glykoforin A - GlyA), pro stanovení antitrombocytárních protilátek a případnou spolupráci s transfúzní službou (kvalita trombo náplavů) - detekce znaků z komplexu CD49, např. CD49f), případně pro diagnostiku některých velmi vzácných krevních malignit (erytroidní leukémie, megakaryoblastová leukémie).

Znaky kmenových a prekursorových buněk

Využití především v diagnostice krevních malignit, útlumů krvetvorby (znaky CD34, CD117, CD45, CD38, HLA-DR) a pro stanovení počtu kmenových buněk ve štěpech pro transplantace kostní dřeně nebo pupečníkové krve (CD34).

Povrchové (membránové) imunoglobuliny na B lymfocytech

Možnost průkazu B buněk před objevem monoklonálních protilátek a charakterizací pan-B znaků. V současnosti se uplatní ve spektru znaků při diagnostice leukémií: B-CLL, lymfomů, monoklonality proliferace B lymfocytů. Poměr kappa:lambda <1 a >3 podporuje úvahu o monoklonalitě B lymfocytární proliferace.

Znaky pro detekci plazmatických buněk

Pro detekci plazmatických buněk je používána monoklonální protilátka specifická pro tuto populaci CD138 (Syndecan 1). Možnost sledování exprese až 4 znaků na povrchu či v cytoplazmě (CD38, CD54, CD56, intracelulární Ig) dovoluje detekci minoritní populace (méně než 1% leukocytární populace).

Stanovení absolutních počtů T lymfocytů - TRUCOUNT

Metoda umožňuje přímé stanovení absolutního počtu CD3+, CD4+ a CD8+ lymfocytárních populací s pomocí referenčních částic. Trucount je využíván především pro monitorování HIV pozitivních pacientů.

Klasický test tvorby E-rozet

Lidské periferní lymfocyty vážou na svůj povrch pomocí CD2 molekuly beraní erytrocyty a vytvářejí tzv. E-rozety. Vazba erytrocytu je realizována ligandou CD58(LFA-3). Naše pracoviště respektuje stanovisko Sekce lab. imunologie ČSAKI, které nedoporučuje provádět vyšetření E-rozet jako metodu pro stanovení celkových T lymfocytů. Mnohaleté zkušenosti našeho pracoviště s monitorováním imunomodulační léčby však opakovaně prokázaly přínos metody E-rozet v této indikaci. Proto toto vyšetření ponecháváme v seznamu prováděných metod s důrazem na specifickou a cílenou indikaci tohoto vyšetření.

Fagocytóza

Prostá fagocytóza HEMA partikulí

Vyšetřuje se sledováním leukocytární ingesce inertních hydroxymetylmetakrylátových partikulí (HEMA). Jedná se o orientační vyšetření z plné krve.

Testy oxidativního vzplanutí fagocytů

Metabolická aktivita fagocytů se zvyšuje po stimulaci povrchové membrány při fagocytárním ději (tzv. metabolické vzplanutí leukocytů). Vyšetření je možné provádět v několika variantách: Při použití opsonizovaného zymozanu jako stimulans dochází k jeho navázání na buněčný povrch (prostřednictvím komplementových CR3 receptorů a Ig Fc receptorů) a následné fagocytóze, aktivaci NADPH oxidázy, degranulaci specifických a azurofilních granul a tvorbě fagolysozómu. Pokud jsou fagocyty stimulovány solubilním stimulans (PMA) dochází přímo k aktivaci NADPH oxidázy a degranulaci. Defekt metabol. vzplanutí je typický pro chronickou granulomatózu (CGD), resp. další neklasifikované defekty fagocytózy, LAD aj.

Chemiluminiscence: Buňky při fagocytóze uvolňují určitá světelná kvanta, která se projevují chemiluminiscencí fagocytů. Po zesílení přirozené chemiluminiscenční aktivity luminofory lze tuto měřit na citlivých přístrojích. Pro sledování produkce reaktivních kyslíkových metabolitů O2- je jako luminofor využíván lucigenin, pomocí luminolu lze detekovat MPO zprostředkovanou tvorbu HOCL. Pro přímou detekci MPO lze využít metody průtokové cytometrie - viz dále. Vyšetření se provádí z plné krve.
INT test: Jedná se o alternativní test pro stanovení metabolické aktivity leukocytů. Při INT testu je metabolická aktivita hodnocena jako redukce jódnitrotetrazoliové soli (INT). Test se provádí s izolovanými PMN bez a po jejich stimulaci.
Burst test: V průběhu oxidativního vzplanutí dochází k oxidaci nefluorescenčního dihydrorhodaminu (DHR 123) na fluorescenčního rhodamin. Nárůst fluorescence oproti kontrole je měřen na průtokovém cytometru.

Chemiluminiscence:- nová varianta testu

V současnosti prováděné testy oxidativního vzplanutí fagocytů (INT a současná podoba chemiluminiscenčního testu) jsou nahrazeny mikrodestičkovou chemiluminiscenční metodou, která umožňuje paralelní použití více stimulans a luminoforů, přesnější monitorování průběhu oxidativního vzplanutí (měření v intervalu tří minut při 37oC)při zachování výhod původního chemiluminiscenčního testu (vyšetření z plné krve, malá náročnost na množství vyšetřované krve).

Charakteristika metody: Buňky při fagocytóze uvolňují určitá světelná kvanta, která lze po zesílení signálu luminofory (luminol, lucigenin) měřit na citlivých přístrojích (luminometrech). Test je prováděn v několika variantách s využitím luminolu nebo lucigeninu a se dvěma stimulačními látkami:

• Lucigenin - využití pro sledování aktivity NADPH oxidázového komplexu (redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfát oxidázy) tj. sledování produkce reaktivních forem kyslíku (např. superoxidového aniontu O2-) 

• Luminol – lze detekovat kromě aktivity NADPH oxidázy také na myeloperoxidáze závislou tvorbu halogenidových derivátů (např. kys. chlorné). 

Stimulační látky: 

• Zymozan - navazuje se na buněčný povrch (v případě opsonizovaného zymozanu prostřednictvím komplementových CR3 receptorů a Ig Fc receptorů, u neopsonizovaného zymozanu se navíc uplatňují další mechanizmy mezi které patří vazba přes Toll like receptory) a následné fagocytóze, aktivaci NADPH oxidázy, která následně reaguje s kyslíkem za vzniku superoxidového aniontu

• PMA (phorbol-myristát-acetát) – solubilní stimulans, využíván pro detekci úplného defektu metabolického vzplanutí, kdy jsou fagocyty stimulovány solubilním PMA. V tomto případě dochází přímo k aktivaci NADPH oxidázy. 

Rozmezí fyziologických hodnot
Výsledky budou uváděny dvěma způsoby:
1) přepočet chemiluminiscenčních impulzů na 1 fagocytující buňku
2) indexem, který je poměrem počtu impulsů stimulovaného a kontrolního (nestimulovaného) vzorku       pacienta

Úplný defekt je typický pro chronickou granulomatózu (CGD), pro heterozygotní přenašeče CGD jsou hodnoty snížené. Snížení lze také očekávat u sekundárních imunodeficiencí (např. HIV+, transplantovaní pacienti). U jedinců s častými infekty může být zjištěna zvýšená spontánní aktivita. Fagocytární aktivitu mohou také ovlivňovat různé imunomodulátory. 

Indikace vyšetření:Vyšetření oxidativního vzplanutí metodou chemiluminiscence je součástí základního vyšetření buněčné imunity. V základním vyšetření bude sledována spontánní aktivita a stimulace NZ/luminol a OZ/luminol. V případě podrobnější analýzy (podezření na úplný defekt) bude sledována i odezva na PMA/luminol a OZ/lucigenin. 

Náklady na vyšetření:Dosavadní vyšetření metodou INT znamenalo bodové ohodnocení 475 nebo 600 bodů (v závislosti na typu separace buněk), stávající vyšetření destičkovou chemiluminiscencí v základním vyšetření (kontrola + dvě stimulans) znamená ohodnocení 510 body, pro každé další stimulans 170 bodů.

Stanovení cytoplazmatické MPO

Deficience myeloperoxidázy je nejčastější poruchou fagocytů. V některých případech se může jednat o úplné chybění tohoto enzymu. U většiny pacientů se tato deficience klinicky neprojeví, někteří pacienti mohou trpět chronickými kandidovými infekcemi. Stanovení se provádí metodou průtokové cytometrie s využitím specifické MP.

Testy cidie

Baktericidie: Baktericidní aktivita leukocytů je testována z plné krve (za možnosti uplatnění sérových faktorů). Jedná se o komplexní vyšetření pro sledování součinnosti humorálních a fagocytárních mechanismů. Více než 50 % přežívajících baktérií poukazuje na sníženou baktericidní schopnost. V případě ATB léčby může být výsledek testu falešně negativní. Testace s vlastním kmenem je vhodná např. u recidivujích IMC.
Kandidacidie: Podobně jako u předchozího testu jde o sledování schopnosti fagocytů pohlcovat a následně usmrcovat v tomto případě Saccharomyces cerevisae. Usmrcené kvasinky se uvolní působením deoxycholátu sodného a jejich množství se určí obarvením metylenovou modří. Výsledek je udáván ve formě indexu vyjadřujícího % usmrcených kvasinek připadajících na 105 fagocytujících buněk. Za hraniční je považována hodnota indexu 4,1.

Funkční testy lymfocytů

Ze širokého spektra funkčních testů, kdy je obvykle po několikadenní stimulaci sledována proliferační schopnost lymfocytů detekcí nově syntetizované DNA, je zde prezentován screeningový test aktivace in vitro.

FAST IMMUNE: V testu je sledován jeden z prvních kroků, který může směřovat k proliferaci lymfocytů. Není možné jej považovat za alternativní test blastické transformace lymfocytů, kde je sledováno množství de novo syntetizované DNA. Po 4h stimulaci lymfocytů PHA nebo komitogenní monoklonální protilátkou CD2/CD2R je sledována exprese časného aktivačního znaku CD69. Snížené hodnoty lze očekávat u některých primárních a sekundárních imunodeficiencí. V případě diferenciální diagnostiky primárních imunodeficiencí je s výhodou využíváno suboptimální koncentrace mitogenu (2,5 ug/ml).

Stanovení CD40L: Průkaz exprese CD154 (CD40 ligandy) po stimulaci PMA na populaci CD4+ lymfocytů je prováděno u pacientů s podezřením na X-chromozóm vázanou formu imunodeficience hyperimunoglobulinémie M (X-HIM).

Další možnosti využití průtokové cytometrie

Protilátky proti trombocytům:

Jsou sledovány protilátky vázané na trombocyty ve tř. IgG a IgM (používány jsou F(ab´)2 fragmenty polyklonální protilátky s příslušnou specifitou). Vyšetření se provádí z plné krve metodou průtokové cytometrie. Anti-trombocytární protilátky jsou nacházeny v souvislosti s trombocytopenií jako primární u idiopatické trombocytopenické purpury, jako sekundární u některých autoimunitních onemocnění (SLE, smíšené choroby pojiva), infekčních chorob (především infekce virového původu)a ve spojitosti s některými malignitami (CLL, non-Hodgkin a Hodgkinskými lymfomy).

Protilátky proti leukocytům:

Stanovení je metodicky shodné s předchozím vyšetřením. Anti-leukocytární protilátky jsou nacházeny některých autoimunitních onemocnění (SLE) a infekčních chorob (především u infekcí virového původu).

Stanovení aktivace basofilů po stimulaci alergenem

Metoda umožňuje průkaz senzibilizace zprostředkované IgE protilátkami (reakce I. typu). Využití je především v oblasti potravinových alergií a u polékových reakcí, kdy kožní, případně expoziční testy jsou obtížně proveditelné. Po inkubaci plné krve s alergenem je sledována exprese aktivačního znaku CD63 na bazofilech. Basofily jsou detekovány prostřednictvím IgE protilátek navázaných na jejich povrchu. Výsledek je vyjádřen jako % basofilů exprimujících CD63.